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嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條性能評(píng)估測(cè)試

嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條性能評(píng)估測(cè)試

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  摘要:對(duì)南京微測(cè)生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條在糧食谷物飼料中的檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg,最低定量限為82μg/kg,線性范圍為100-5000μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%,同一個(gè)樣本的檢測(cè)3次的CV<14.75%,與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%,與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。該產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),適合用于對(duì)糧食谷物飼料中嘔吐毒素的進(jìn)行快速定量測(cè)定。

  關(guān)鍵詞:嘔吐毒素快速定量檢測(cè);熒光定量免疫層析;嘔吐毒素;糧食谷物飼料

  嘔吐毒素主體成分為DON(deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇),屬于單端孢霉烯族化合物,主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。另外,頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產(chǎn)生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種,是一類強(qiáng)有力免疫抑制劑,所引起典型癥狀是采食量降低,所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素(DON)是其中最重要一種毒素,主要來(lái)自鐮刀菌屬(Fusarium),尤其是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)。由于它可以引起豬的嘔吐,故又名嘔吐毒素(vomitoxin,VT)。


  該毒素最早于1970年在日本香川縣的一次赤霉病大麥中毒的病毒中發(fā)現(xiàn),1972年,由日本的Morooka等首次從赤霉病大麥中分離,Yoshizawa等闡明了這種新的真菌毒素的結(jié)構(gòu),并將其命名為4-deoxynivalenol(DON)。1973年Vesonder等在美國(guó)從被鐮刀菌污染的玉米中分離出了同樣的化學(xué)物質(zhì),因?yàn)樵摲N物質(zhì)可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥狀,故命名為嘔吐毒素,并相繼發(fā)現(xiàn)可以在赤霉病大麥、被鐮刀菌污染的玉米中分離出該物質(zhì)。嘔吐毒素是食品中常見(jiàn)的真菌毒素,在自然界中廣泛存在,通常在歐洲及北美發(fā)現(xiàn)的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。由于它們具有很高的細(xì)胞毒素及免疫抑制性質(zhì),因此,對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅,特別是對(duì)免疫功能具有明顯的影響。根據(jù)DON的劑量和暴露時(shí)間不同可引起免疫抑制或免疫刺激。當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后,會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。由于中國(guó)傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例大大高于西方,使得嘔吐毒素的危害更為突出。1998年,在國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中,嘔吐毒素被列為3類致癌物。歐盟要求嘔吐毒素要小于1.0mg/kg;中國(guó)谷物飼料中要求嘔吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg,飼料中低于5 mg/kg。


  目前,國(guó)標(biāo)法測(cè)定嘔吐毒素需要大型的儀器設(shè)備,價(jià)格昂貴,操作過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng),且無(wú)法在現(xiàn)場(chǎng)和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外,也有采用嘔吐毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測(cè)試紙條用于大量樣品的篩查,操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)快速,成本也較低,但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差,容易造成假陽(yáng)性或者假陰性。因此,急需一種既簡(jiǎn)便快速,又能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)方法,熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過(guò)對(duì)多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測(cè),驗(yàn)證了南京微測(cè)生物開(kāi)發(fā)的嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)試紙條的技術(shù)性能。


  1實(shí)驗(yàn)材料和方法

  1.1試劑和材料

  除注明外,均為分析純,試驗(yàn)用水均為UP水。

  熒光熒光定量檢測(cè)試紙條(由包被有熒光微球標(biāo)記嘔吐毒素抗體的乳膠墊、噴涂有嘔吐毒素抗原的檢測(cè)線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成)、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由南京微測(cè)生物科技有限公司提供。

  嘔吐毒素及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品:購(gòu)自Sigma公司;

  大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購(gòu)得或從企業(yè)取樣。

  麩皮,小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

  1.2儀器與設(shè)備

  FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器,南京微測(cè)生物科技有限公司提供;低速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電子天平:Sartorius;

  1.3試驗(yàn)方法

  1.3.1樣品的前處理

  取具有代表性的待測(cè)樣品500g,用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過(guò)20目篩,收集過(guò)篩的細(xì)小樣品。稱取1.0±0.02g過(guò)篩的樣品于10mL離心管中,加入5mL提取液,用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min)后,4000RPM離心1min,取上清。

  1.3.2檢測(cè)過(guò)程

  取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中,用漩渦混勻器混勻3-5s,然后取100μL加入到嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條的加樣孔中,置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后,將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù),即為樣品的實(shí)際檢測(cè)濃度。當(dāng)檢測(cè)值大于5000μg/kg時(shí),可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測(cè),所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。


  2檢測(cè)結(jié)果分析

  2.1線性范圍與檢出限

  取7個(gè)無(wú)污染(陰性)小麥樣品和7個(gè)無(wú)污染(陰性)玉米樣品,分別添加100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg、2500μg/kg、5000μg/kg 的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品,用上海飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次,以添加濃度為為縱坐標(biāo),以熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo),擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù),結(jié)果如下:


嘔吐毒素檢測(cè)卡符合率

  圖1 小麥中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系


嘔吐毒素檢測(cè)卡符合率

  圖2 玉米中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系

  計(jì)算得出小麥的線性范圍:100~5000μg/kg(6點(diǎn)), 回歸方程: y = 0.981x + 60.52,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997;玉米的線性范圍:100~5000μg/kg(6點(diǎn)), 回歸方程: y = 0.976x + 52.00,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998;(見(jiàn)圖1和圖2)。

  取10個(gè)無(wú)污染(陰性)小麥樣品和10個(gè)無(wú)污染(陰性)玉米樣品,用上海飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次,檢測(cè)限(LOD)為測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,定量限(LOQ)為測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)試結(jié)果表明,DON的LOD為25μg/kg,LOQ為82μg/kg。

  2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

  在用國(guó)標(biāo)法測(cè)定為0的空白樣品中分別添加嘔吐毒素總量為100,250,500,1000,2000,5000μg/kg,然后按照嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

不同樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

樣本

平行試驗(yàn)

嘔吐毒素添加量(μg/kg

100

250

500

1000

2000

5000

大米

1

85.11

238.22

550.48

1177.61

2163.89

5389.09

2

96.24

292.53

498.09

996.97

2213.41

5392.65

3

104.88

287.88

532.44

1109.43

2290.42

5183.43

平均值(μg/kg

95.41

272.88

527.00

1094.67

2222.57

5321.73

平均回收率

95.41%

109.15%

105.40%

109.47%

111.13%

106.43%

變異系數(shù)CV

10.39%

11.03%

5.05%

8.33%

2.87%

2.25%

玉米

1

84.91

206.35

550.71

1168.65

2312.11

5476.15

2

109.43

198.88

512.57

1046.64

2015.44

5286.45

3

92.02

221.09

533.23

1099.93

2175.27

5148.01

平均值(μg/kg

95.46

208.77

532.17

1105.07

2167.61

5303.54

平均回收率

95.46%

83.51%

106.43%

110.51%

108.38%

106.07%

變異系數(shù)CV

13.22%

5.41%

3.59%

5.54%

6.85%

3.11%

小麥

1

84.91

239.35

577.71

1168.65

2312.11

4976.15

2

89.43

302.88

550.57

1146.64

2015.44

5314.45

3

92.02

282.09

539.23

1099.93

2175.27

5299.01

平均值(μg/kg

88.79

274.77

555.84

1138.40

2167.61

5196.54

平均回收率

88.79%

109.91%

111.17%

113.84%

108.38%

103.93%

變異系數(shù)CV

4.05%

11.79%

3.56%

3.08%

6.85%

3.68%

面粉

1

113.13

287.93

509.07

940.74

2378.39

5011.52

2

118.68

262.21

566.04

1108.73

2112.45

5389.32

3

89.02

244.32

546.44

1137.03

2352.04

5203.04

平均值(μg/kg

106.94

264.82

540.52

1062.17

2280.96

5201.30

平均回收率

106.94%

105.93%

108.10%

106.22%

114.05%

104.03%

變異系數(shù)CV

14.74%

8.28%

5.35%

9.99%

6.42%

3.63%

  從表1可以看出,南京微測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條測(cè)試不同糧食谷物中嘔吐毒素的添加回收率在83.51%~113.84%,3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.75%以內(nèi)。

  2.3與色譜方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

  大米、小麥、玉米、面粉、麩皮、噴漿玉米、大豆、豆粕各1份共24個(gè)樣本,先采用國(guó)標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測(cè)定,再使用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定,各測(cè)試3個(gè)平行樣。檢測(cè)結(jié)果如下:

2  與液相色譜法結(jié)果比對(duì)μg/kg

樣本

大米

小麥

玉米

面粉

麩皮

噴漿玉米

大豆

豆粕

色譜值

1420.323

802.095

347.09

1890.966

4290.024

1276.420

2209.442

68.502

飛測(cè)生物值

1

1509.10

889.22

422.36

2099.31

4786.03

1394.44

2503.56

73.04

2

1433.43

948.34

390.02

2011.03

4603.89

1203.09

2557.48

63.09

3

1579.32

867.56

379.48

2133.03

4580.53

1334.04

2314.75

77.67

平均值

1485.54

876.80

384.74

2033.58

4565.12

1302.00

2396.31

70.58

符合度

104.59%

109.31%

110.85%

107.54%

106.41%

102.00%

108.46%

103.03%

CV

4.96%

6.89%

8.06%

5.32%

4.49%

6.27%

6.77%

8.84%

2表明,在不同的糧食谷物飼料中,南京微測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條與液相色譜法的符合率為102.00%~110.85%,3次重復(fù)測(cè)定的的CV值在8.84%以內(nèi)。

      2.4方法特異性

選擇 DON結(jié)構(gòu)類似物和其他5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加,添加的濃度為1000 μg/kg,然后用飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值;結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A,伏馬菌素B1,黃曲霉毒素B1T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均<5%,與其代謝物、結(jié)構(gòu)類似物有一定的交叉反應(yīng)(<20%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嘔吐毒素膠體金試劑條對(duì)伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無(wú)交叉反應(yīng),其方法特異性可以能滿足檢測(cè)要求。

3 交叉反應(yīng)率表

序號(hào)

名稱

測(cè)定值

交叉反應(yīng)率

1

嘔吐毒素DON

1124

100.00%

2

赭曲霉毒素A (OTA)

36

3.6%

3

伏馬菌素B1FB1

41

4.1%

4

黃曲霉毒素B1(AFB1)

25

2.5%

5

玉米赤霉烯酮(ZEN)

29

2.9%

6

T-2毒素(T-2)

47

4.7%

7

3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

138

13.8%

8

15-乙?;撗跹└牭毒┐?/span>

165

16.5%


  3結(jié)論

  本實(shí)驗(yàn)采用南京微測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條對(duì)不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測(cè)試,該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg,最低定量限為82μg/kg,線性范圍為100-5000μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%,同一個(gè)樣本的檢測(cè)3個(gè)樣本的CV<14.75%,與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%,與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國(guó)對(duì)嘔吐毒素的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn),可用于不同糧食谷物飼料中嘔吐毒素的快速定量檢測(cè)分析。


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